Mémoire De Diplôme Année : 2021

Regulation of the renal co-transporter NKCC2 by protein-protein interactions : role of the protein α-1,2 Mannosidase IA, ManIA

Régulation du co-transporteur rénal NKCC2 par les interactions protéine-protéine : rôle de la protéine α-1,2 Mannosidase IA, ManIA

Résumé

The kidney-specific apical Na+-K+-2Cl- cotransporter (NKCC2) plays an essential role in the body's hydroelectrolyte homeostasis. Mutations in the cotransporter gene are the cause of Bartter syndrome type 1 (BS1), a rare inherited disorder that can be life-threatening if not treated early. BS1 is characterized by arterial hypotension and electrolyte disorders. Our previous work demonstrated that the vast majority of newly synthesized NKCC2 proteins in the endoplasmic reticulum (ER) are degraded by the ERAD system, suggesting that NKCC2 transit in the ER is a limiting step in cotransporter trafficking to the plasma membrane. However, to date, very little is known about the molecular determinants regulating NKCC2 ERAD. In this study, using the yeast two-hybrid system, we identified Golgian mannosidase alpha class 1A member 1 (ManIA) as a new protein partner of NKCC2. ManIA is a hydrolase involved in both the maturation and ERAD of secretory pathway proteins. Coimmunoprecipitation and immunofluorescence experiments in cultured kidney cells revealed that ManIA interacts only with the immature form of NKCC2, and that this interaction occurs at the Cis-Golgi level. Increasing ManIA levels massively decreased total NKCC2 protein abundance, while knocking it down produced the opposite effect. Interestingly, the action of ManIA was more pronounced in some NKCC2 mutants. Cycloheximide-chase experiments demonstrated that the reduction of NKCC2 by ManIA is secondary to increased degradation of its immature form. The effect of ManIA on NKCC2 was abolished following inhibition of the proteasome by MG132, while inhibition of the lysosome by chloroquine produced no results. Kifunensine, an inhibitor of mannosidase alpha 1,2, also massively prevents the effect of ManIA on NKCC2, demonstrating that N-glycosylation is necessary for the enzyme's action on the cotransporter. In conclusion, our results demonstrate the involvement of ManIA in the NKCC2 ERAD system. We postulate that, under conditions of ER stress, ManIA plays a crucial role in the Golgi retention, retrograde transport and proteasome degradation of misfolded NKCC2 proteins that have escaped ER quality control, thus revealing a new mode of cotransporter regulation.
Le co-transporteur apical Na+-K+-2Cl- (NKCC2), spécifique du rein, joue un rôle essentiel dans l’homéostasie hydroélectrolytique de l’organisme. Des mutations dans le gène du cotransporteur sont à l’origine du syndrome de Bartter anténatal de type 1 (BS1), un trouble héréditaire rare, dont le pronostic vital peut être engagé en l’absence de traitement précoce. Le BS1 est caractérisé par une hypotension artérielle et un désordre électrolytique. Nos travaux antérieurs ont démontré que la vaste majorité des protéines NKCC2 nouvellement synthétisées dans le réticulum endoplasmique (RE) sont dégradées par le système ERAD, suggérant ainsi que le transit de NKCC2 dans le RE est une étape limitante dans le trafic du cotransporteur vers la membrane plasmique. Cependant, à ce jour, les déterminants moléculaires régulant l’ERAD de NKCC2 sont très peu connus. Dans cette étude, nous avons identifié, grâce au système double hybride dans la levure, la mannosidase Golgienne alpha classe 1A membre 1 (ManIA) comme nouveau partenaire protéique de NKCC2. La ManIA est une hydrolase impliquée aussi bien dans la maturation que dans l’ERAD des protéines de la voie de sécrétion. Les expériences de coimmunoprécipitation et d’immunofluorescence dans les cellules rénales en culture ont révélé que la ManIA interagit uniquement avec la forme immature de NKCC2, et que cette interaction se produit au niveau du Cis-Golgi. L’augmentation des taux de la ManIA a diminué massivement l'abondance totale de la protéine NKCC2 alors que son knock-down a produit l'effet opposé. D’une manière intéressante, l’action de la ManIA s’est avérée plus prononcée sur certains mutants de NKCC2. Les expériences de cycloheximide-chase ont démontré que la réduction de NKCC2 par la ManIA est secondaire à l’augmentation de la dégradation de sa forme immature. L’effet de la ManIA sur NKCC2 a été aboli à la suite de l’inhibition du protéasome par MG132, alors que l’inhibition du lysosome par la chloroquine n’a produit aucun résultat. La kifunensine, inhibiteur des mannosidase alpha 1,2, prévient également massivement l’effet de la ManIA sur NKCC2 démontrant ainsi que la N-glycosylation est nécessaire à l’action de l’enzyme sur le cotransporteur. En conclusion, nos résultats démontrent l’existence d’une implication de la ManIA dans le système ERAD de NKCC2. Nous postulons, qu’en conditions du stress du RE, la ManIA joue un rôle crucial dans la rétention au niveau du Golgi, le transport rétrograde et la dégradation par le protéasome des protéines NKCC2 mal-repliées qui ont échappé au contrôle de qualité du RE, révélant ainsi un nouveau mode de régulation du cotransporteur.
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Citer

Sylvie Demaretz. Régulation du co-transporteur rénal NKCC2 par les interactions protéine-protéine : rôle de la protéine α-1,2 Mannosidase IA, ManIA. Sciences du Vivant [q-bio]. 2021. ⟨hal-04861847⟩
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