Développement d’un modèle cellulaire de motoneurones humains à partir de cellules iPS pour l’étude des mécanismes physiopathologiques et l’analyse fonctionnelle d’un variant de séquençage impliqué dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth - EPHE - École pratique des hautes études
Mémoire De Diplôme Année : 2023

Développement d’un modèle cellulaire de motoneurones humains à partir de cellules iPS pour l’étude des mécanismes physiopathologiques et l’analyse fonctionnelle d’un variant de séquençage impliqué dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth

Résumé

La maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT) est une neuropathie périphérique génétique rare pour laquelle des mutations dans plus de 80 gènes ont été identifiées comme pathogènes. Cependant plus de 30% des patients restent sans diagnostic moléculaire faute d’identification d’une mutation dans un gène connu et 30% possèdent un variant dans un gène associé à la maladie mais dont la signification pathologique n'est pas certaine 2. Afin d’améliorer le diagnostic et la compréhension de la physiopathologie des maladies génétiques du système nerveux périphérique (SNP), il était nécessaire de développer des modèles fonctionnels in vitro basés sur les types cellulaires atteints dans ces pathologies. Mon travail a donc débuté par la mise en place d’un protocole de différenciation des cellules iPS humaines en motoneurones (Maury et al 20154 6 ). Afin de compléter ce modèle, des cultures 3D en sphéroïdes et des co cultures ont été développées pour se rapprocher autant que possible du contexte in vivo. Le modèle de cultures 2D de motoneurones, le plus robuste, a ensuite été utilisé pour l’étude de variants du gène NF-H impliqués dans la CMT2CC. Cette forme de CMT est caractérisée par une neuropathie axonale sévère, à prédominance motrice due à des mutations du gène Neurofilament Heavy Chain (NF-H). Cette protéine du cytosquelette joue un rôle dans la croissance axonale mais également dans la régulation du réseau de microtubules ce qui lui confère indirectement un rôle dans le transport axonal. Mon travail a porté sur la différenciation de deux lignées iPS issues de patients portant deux variants provoquant la perte d’un codon stop. Des résultats de surexpression des protéines mutées en système hétérologue avaient suggéré que les mutations induisaient la formation d’agrégats. Sur cette base, j’ai travaillé à décrire le phénotype des motoneurones issus des cellules iPS dérivées des patients et notamment à confirmer la formation des agrégats. Les marquages de NF-H en immunofluorescence après 24 jours de culture in vitro n’ont pas permis de visualiser d’agrégats. Les expériences de western blot ont montré une augmentation de la quantité d’-tubuline dans les lignées issues des patients, suggérant que les mutations induisent des changements du réseau de microtubules comme précédemment décrit dans des modèles cellulaires déplétés en protéines NF-H4 4 , 5 1. Enfin, l’analyse transcriptomique des motoneurones a permis d’identifier une liste de gènes dérégulés dans les cellules des patients, ouvrant de nouvelles pistes d’investigations pour la compréhension de la physiopathologie de la CMT2CC. Au final, en procurant des systèmes in vitro proches du contexte physiologique, ce travail montre que les modèles cellulaires basés sur les cellules souches iPS constituent des outils de choix pour l’étude de la physiopathologie des maladies neuromusculaires. Nos travaux ouvrent la voie au développement de systèmes cellulaires pour l’interprétation de variants de signification inconnue qui, avec l’avènement de l’ère post-génomique et le développement des méthodes de séquençage toujours plus puissantes, constitue un des grands défis hospitaliers.
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Origine Fichiers produits par l'(les) auteur(s)

Dates et versions

hal-04325460 , version 1 (06-12-2023)

Identifiants

  • HAL Id : hal-04325460 , version 1

Citer

Julien Carras. Développement d’un modèle cellulaire de motoneurones humains à partir de cellules iPS pour l’étude des mécanismes physiopathologiques et l’analyse fonctionnelle d’un variant de séquençage impliqué dans la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Sciences du Vivant [q-bio]. 2023. ⟨hal-04325460⟩
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